Tetap bercerita seputar museum. Film ini dimulai dengan pemindahan sebagian besar koleksi museum Sejarah Nasional ke museum Washington, museum terbesar di dunia, karena akan dilakukan renovasi dan pembaharuan fasilitas ke arah yang lebih modern. Film ini berpusat kepada suku Smithsonian, karena jumlah mereka yang terbesar di museum Washington. Misi Larry (Ben Stiller) kali ini adalah untuk menyelamatkan "teman-teman" museum Sejarah Nasional nya dari serangan Kahmunrah, sosok jahat yang ingin menguasai dunia dengan menggunakan sebuah batu yang dimiliki oleh Larry yang dapat memanggil arwah-arwah dari neraka. Pertengkaran ini melibatkan Theodore Roosevelt dan Dexter serta pendatang baru, Jenderal Custer dan Al Capone.